http://www.ziddu.com/download/4018151/kpss2008onlisans-matematiksorularive.pdf.html
Deneyin Adı:Diyaliz ve Ultrafiltrasyon
Deneyin Amacı:Kan plazması kullanarak amonyum sülfat çöktürmesiyle proteinleri denatüre etmeden gradient çöktürmeyle diyalizlenmesi
Teorik Bilgi:Proteinlerin amonyum sülfat çöktürmesinin neden tercih edildiği ve ‘salting in’ ,’salting out’ hakkında bilgi
Amonyum sülfat [(NH4)2SO4] çöktürmesi, kabaca çözeltinin tuz konsantrasyonunu artırarak proteinin çözünürlüğünü değişmesi ve bunun sonucunda denatüre olmadan çökmesine dayanan bir çöktürme yöntemidir. Bu yönteme genel olarak “salting-out” denir. Amonyum sülfat, genelde ucuz olması, çözünürlüğünün yüksek olması ve enzim yapılarına zarar vermeyen bir yapıda olması sebebiyle çok tercih edilen bir çöktürücü ajandır.
Proteinlerin çözünürlüğü, içinde bulundukları çözelti ortamının iyon şiddetine bağlıdır. İyon şiddetinin değişmesine bağlı olarak proteinler 2 etkiye maruz kalırlar: Birincisi tuz konsantrasyonlarının düşük bir değerden itibaren artırılmaya başlanması, proteinlerin çözünürlüğünü de artıracaktır ki bu etkiye “salting-in” denir. İkinci etki ise, çözeltinin tuz konsantrasyonu artırılmaya devam edilirse, bu sefer proteinlerin çözünürlükleri artık artmayıp düşmeye başlayacaktır. Bir süre sonra, çözeltide iyonik hale geçen tuz moleküllerinin suyla gireceği etkileşimler sonucu, proteinlerin çevresinde solvatize halde bulunan su molekülleri proteinlerin etrafından ayrılmak durumunda kalacaktır. Proteinlerin yüzeylerinde bulunan hidrofobik bölgeler ise, su molekülleri çevrelerinden gittiği için, birbirleri ile etkileşime girmeye başlayacaklar ve proteinler çökelmeye başlayacaklardır ki bu etkinin bütününe de “salting-out” denir.
Yüksek iyon şiddeti değerlerinde, proteinlerin çözünürlük değerleri önemli derecede birbirinden ayrıldıkları için, amonyum sülfat çöktürmesi istenilen bir proteinin saflaştırılmasında kullanılan iyi bir yöntemdir.
Çöktürme yapılırken, amonyum sülfat derişimi her adımda biraz daha artırılarak, her adımda çöken proteinler toplanabilir. Çöktürme işleminin yapılacağı her adımda, gerekli ola amonyum sülfat miktarı hesaplanmalı ve fazla katım yapılmamalıdır.
Amonyum sülfatın çözeltiye katımı ve istenilen proteinlerin çökmesi sonunda, çöken proteinler santrifüjlenme yapılarak çözeltiden ayrılabilir. Bu teknik, kontamine olmuş büyük miktardaki proteinlerin elimine edilmesi açısından çok yararlı ve kullanışlı bir tekniktir.
Deneyin Yapılışı: Deneyimizde diyaliz denemesinde kullanacağımız proteini serumdan elde edebilmemiz için önce çöktürme işlemi uyguladık. Kan serum hacmi bir mezüre alınarak hacmi 2,5 ml olarak ölçülür. Ardından 1:3 oranında seyreltme olması için üstüne 7,5 ml Fosfat tamponu eklenir. Toplam hacmimiz böylece 10 ml olmuş olur. %20’lik amonyum sülfat çöktürmesi işlemi için deney notundaki tablodan ne kadar amonyum sülfat tartılması gerektiği bakılır. Deney notundaki tablo
x = (10 ml .
Serum santrifüjden geldikten sonra, tüpte dibe çöken proteinler alınarak üzerlerine 5 ml saf su konur ve birinci diyaliz torbası içine konur, torba içine basınç oluşturması için hava üflenir, membranın üstü ve altı sıkıca bağlandıktan sonra su dolu kabın içine bırakılarak dengeye gelmesi beklenir.
1. çöktürmeden kalan süpernatant ise, %50’lik amonyum sülfat çöktürmesine tabi tutulacaktır. Bu yüzden 2 süpernatant alınır, mezürde toplanarak ölçülür, toplam hacim 10 ml gelir. 10ml çözelti için gerekli olan amonyum sülfat miktarı; x= (10 . 189) /1000 = 1,89 gr’dir. Bu miktar hassas tartıda tartılır. Çözelti yine buz banyosu içine konur ve içine bir manyetik bar atılır ve manyetik karıştırıcının üzerinde amonyum sülfat yavaş ancak seri bir şekilde eklenir. Ekleme bittikten sonra dengeye gelmesi için 15 dk beklenir ve beklendikten sonra 10 dk boyunca 10000rpm 4’C de santrifüjlenmesi için santrifüje gönderilir. Santrifüjden geldikten sonra, dibe çöken proteinler alınır, 5 ml saf su eklenerek çözelti vortexlenir ve 2. diyaliz torbasına da birinciyle aynı şekilde hava üflenir, altı ve üstü düğümlenir ve içi saf su dolu kaba bırakılarak dengeye gelmesi beklenir.
2. çöktürmeden kalan süpernatant kısmı, %100’lük amonyum sülfat çöktürmesine tabi tutulmak için bir mezüre alınarak hacmi ölçülür. Hacim 10ml gelir. 10 ml çözelti için ne kadar amonyum sülfat miktarı gerektiği hesaplanır. x= (10 . 392) / 1000 = 3.92 gr. 3.92gr amonyum sülfat hassas tartıda tartılır, çözelti yine buz banyosuna alınır ve manyetik karıştırıcı üzerinde amonyum sülfat yavaş ancak seri bir şekilde eklenir. Ekleme bittikten sonra ortamın dengeye gelmesi için 15 dakika beklenir. Bu süre sonunda 10 dakika boyunca 10000rpm 4’C de santrifüjlenmesi için tüpler santrifüje gönderilir. Tüpler santrifüjden geldiğinde, tüplerin içindeki çökelekler alınarak üzerlerine 5 ml saf su eklenir ve oluşan çözelti vortexlenir. Bu oluşan çözelti ise 3. diyaliz torbasına konur ve torbanın üstünden hava üflenerek, torbanın altı ve üstü sıkıca düğümlenerek, torba saf su dolu kabımıza konur ve diyalizin dengeye gelmesi beklenir.
3. çöktürmeden kalan tüplerin süpernatant kısmı da alınır, önceki işlemlerde olduğu gibi üzerine 5 ml saf su eklenir ve 4. diyaliz torbasına konur. Diyaliz torbasına hava üflenir, alttan ve üstten düğümlendikten sonra, içi saf su dolu kaba bırakılarak dengeye gelmesi beklenir.İşlem sonunda diyaliz kabında 4 ayrı fraksiyonumuz var.3’ü çökelek 4. sü de en son kalan çözelti olmak üzere.En son olarakta bütün grupların diyaliz işlemlerinin bulunduğu kabımızı soğuk odaya götürdük ve karıştırıcı ile diyaliz membranlarına akım sağlamak amacıyla karıştırıcı düzeneğine bıraktık.